γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）是還原型谷胱甘肽（GSH）合成的限速酶，GSH對GCL有反饋抑制作用。GCL基因表達受多種因素調節，如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL活性的高低對于GSH含量和GSH/GSSG比值有非常重要的影響。 本試劑盒可檢測生物體內GCL活性，其原理是在ATP和Mg2+存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同時ATP去磷酸化產生無機磷分子，通過測定無機磷增加速率，即可計算出GCL活性。
酶標儀或可見分光光度計（能測660 nm處的吸光度）及水浴鍋
96孔板或微量玻璃比色皿、可調節式移液槍及槍頭
低溫離心機、制冰機
去離子水和濃硫酸
勻漿器（如果是組織樣本）
注意：各組分（小管試劑）開蓋前，請先低速離心。
提取液：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。
試劑一：臨用前96 T加6 mL去離子水，48 T加3 mL去離子水，充分震蕩溶解，用不完的試劑分裝-20℃保存，避免反復凍融。
試劑二：臨用前加96 T加1.5 mL去離子水，48 T加0.75 mL去離子水，充分震蕩溶解。（配制完成后，4℃保存，請一周內使用完。）
試劑三：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。
試劑四：臨用前96 T加12 mL去離子水，48 T加6 mL去離子水，充分震蕩溶解后，96 T緩緩加入400 μL濃硫酸（自備），48 T緩緩加入200 μL濃硫酸（自備）邊加邊攪拌。
注意：濃硫酸具有強腐蝕性，請注意安全。配制過程中，可能會產生黑色固體，其不影響結果，注意吸取時不要將黑色固體吸入。該溶液配制完成后應為淺黃色，若為藍色則已污染，不可再使用。
標準曲線設置： 按下表所示用去離子水將8μmol/mL標準液稀釋成0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.125 μmol/mL標準溶液。
標準品體積 | 去離子水體積（μL） | 標準品濃度（μmol/mL） | |
Std.1 | 100 μLof 8 μmol/mL | 900 | 0.8 |
Std.2 | 100 μL of Std.1（0.8 μmol/mL） | 100 | 0.4 |
Std.3 | 100 μL of Std.2 (0.4 μmol/mL) | 100 | 0.2 |
Std.4 | 100 μL of Std.3 (0.2 μmol/mL) | 100 | 0.1 |
Std.5 | 100 μL of Std.4 (0.1 μmol/mL) | 100 | 0.05 |
Std.6 | 100 μL of Std.5 (0.05 μmol/mL) | 100 | 0.025 |
Std.7 | 100 μL of Std.6 (0.025 μmol/mL) | 100 | 0.0125 |
注意：每次實驗，請使用新配制的標準品。
1. 動植物組織樣本：稱取約0.1 g組織，加入1mL 提取液，進行冰浴勻漿，8,000 g，4℃離心10 min，取上清，置冰上待測。
2. 細菌、真菌、細胞：收集500萬細胞加入1 mL 提取液，冰浴超聲波破碎細胞5 min（功率20%或200 W，超聲3 s，間隔7 s，重復30次）；然后8,000 g，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測。
3. 血清（漿）等液體：直接測定。
注意：1. 推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力，以免影響其活力。如果是勻漿液，避免反復凍融。
2. 細胞中GCL活性測定時，細胞數目須在300萬-500萬之間，細胞中GCL的提取時可加提取液后超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞。
3. 如需要進行樣本蛋白質濃度測定時，推薦用BCA法蛋白質定量試劑盒。
1. 酶標儀或可見分光光度計預熱30 min以上，調節波長到660 nm，可見分光光度計去離子水調零。
2. 水浴鍋預熱到37℃。
3. 樣本測定（在EP管中依次加入下列試劑）：
空白管（μL） | 標準管（μL） | 測定管（μL） | 對照管（μL） | |
提取液 | 0 | 0 | 48 | 48 |
試劑一 | 0 | 0 | 52 | 52 |
試劑二 | 0 | 0 | 12 | 12 |
樣本 | 0 | 0 | 24 | 0 |
混勻后蓋緊，37℃水浴反應15 min | ||||
試劑三 | 0 | 0 | 60 | 60 |
樣本 | 0 | 0 | 0 | 24 |
混勻后，室溫（25℃左右）8,000 g，離心10 min | ||||
上清 | 0 | 0 | 100 | 100 |
標準品 | 0 | 100 | 0 | 0 |
去離子水 | 100 | 0 | 0 | 0 |
試劑四 | 100 | 100 | 100 | 100 |
混勻后蓋緊，45℃水浴10min，冷卻至室溫后測定660 nm處光吸收，盡快測完，分別記為A空、A測定、A標、A對照。計算 ΔA測=A測定-A對照，ΔA標=A標準-A空白，空白管只需做一個 | ||||
注意：測定吸光值時，請于水浴后10-40min內測完。樣本測定前先取2-3個樣做預實驗，如ΔA測大于1.5，應先用提取液（或生理鹽水）稀釋到適當倍數，使得吸光值在標準曲線范圍內，哺乳動物組織和血液一般稀釋3-5倍，計算公式中乘以相應稀釋倍數。
1. 標準曲線的繪制：
以標準溶液濃度為y軸，ΔA標為x軸，繪制標準曲線（濃度為y軸更方便計算結果）。
2. γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）活性的計算
根據標準曲線，將ΔA測帶入公式中（x）計算樣品無機磷濃度y（μmol/mL）。
（1）按蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產生1 μmol無機磷的GCL酶活量為1個酶活力單位。
GCL(U/mg prot)=(y×V反總)÷(Cpr×V樣)÷T=0.54×y÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
活性單位定義：37℃下，每克樣品每分鐘催化產生1 μmol無機磷的GCL酶活量為1個酶活力單位。
GCL(U/g 鮮重)=(y×V反總)÷(W÷V樣總×V樣)÷T=0.54×y÷W
（3）按細胞數量計算
活性單位定義：37℃下，每104個細胞每分鐘催化產生1 μmol無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL(U/104 cell)=(y×V反總)÷(500×V樣÷V樣總)÷T=1.08×10-3×y
（4）按血清（漿）等液體體積計算
活性單位定義：37℃下，每毫升液體每分鐘催化產生1 μmol無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。
GCL(U/mL)=(y×V反總)÷V樣÷T=0.54×y
V反總：反應總體積，0.196 mL；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL；V樣：加入樣品體積，0.024 mL；T：反應時間，15 min；W：樣品鮮重，g；V樣總：加入提取液的體積，1 mL；500：細菌或細胞總數，500 萬
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答：可能的原因有：
1、膠凝的不均勻或聚合不好，建議灌膠前將溶液充分混勻；
2、某些樣品鹽濃度較高，建議除鹽或將樣品鹽濃度調成一致；
3、緩沖液陳舊，成分改變,可以重配；
4、凝膠下面有氣泡,電泳前要先將氣泡趕走；
5、電泳時溫度過高，可以降低電流或電壓；
6、樣品中含有不溶性顆粒，建議樣品充分攪拌混勻。
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