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鏈cDNA合成試劑盒是一個用于從mRNA或總RNA模板高效合成鏈cDNA的完整系統(tǒng)。該試劑盒使用RevertAid逆轉錄酶(RT)，其RNase H活性與AMV逆轉錄酶相比較低。該酶在42-50°C下保持活性，適用于合成高至13kb的cDNA。試劑盒附帶的重組RNase抑制劑可有效保護RNA在高達55°C的溫度下降解。本試劑盒合成的鏈cDNA可以直接用于PCR或實時PCR的模板，也可以用于第二鏈cDNA合成或線性RNA擴增。放射性和非放射性標記的核苷酸可以作為探針將其用于鏈cDNA中用作雜交實驗(包括微陣列)。

一、模板RNA

本試劑盒適用于通過標準方法分離的總細胞RNA。純化的RNA必須不含鹽、金屬離子、乙醇和苯酚，以避免抑制cDNA合成反應。微量污染物可以通過RNA的乙醇沉淀去除，然后用75%的冷乙醇洗滌兩次。     

對于RT-PCR，模板RNA必須沒有DNA污染。在cDNA合成之前，可以用無RNase的DNase I處理RNA以去除痕量的DNA。實驗時需設置對照組（RT-），該反應包括除逆轉錄酶外的RT-PCR所有成分。

二、RNA樣本質量

在cDNA合成之前評估RNA的完整性，常見的方法是變性瓊脂糖凝膠電泳，然后用溴化乙錠染色。如果真核生物總RNA電泳后18S和28S rRNA都出現尖銳條帶，則認為RNA模板是完整的。28S rRNA條帶的亮度大約是18S rRNA的兩倍。rRNA條帶的任何拖尾現象都表明mRNA降解。如果發(fā)生這種情況，應制備新的總RNA樣本。

作為兩步法RT-PCR的步，合成鏈cDNA需要使用0.1ng-5μg的總RNA或1ng-500ng的poly(A) mRNA。若用于第二鏈合成和隨后的克隆反應，合成鏈cDNA需使用1ug分離的mRNA。

三、合成鏈cDNA

解凍后，將試劑盒的各組分短暫離心，在冰上儲存。

1. 按順序將以下試劑加入冰上無菌、無核酸酶的PCR管中。

2. 如果RNA模板富含GC或含有二級結構，輕輕混合，短暫離心，在65°C下孵育5分鐘。在冰上冷卻備用。

3. 按表中順序向第1步的PCR管繼續(xù)添加組分。

4. 輕輕混合并短暫離心。

5. 對于使用Oligo(dT)₁₈ primer 或 gene-specific primer的cDNA合成，在42℃下孵育60分鐘。對于使用Random Hexamer primer的cDNA合成，在25℃下孵育5分鐘，然后在42℃下溫育60分鐘。(注意：對于富含GC的RNA模板，反應溫度可以提高到45℃)

6. 在70°C下加熱5分鐘終止反應。 逆轉錄反應產物可以直接用于PCR，也可以在-20°C下儲存不到一周。若需要長期儲存，建議于-70°C保存。

四、鏈cDNA的PCR擴增

鏈cDNA合成的產物可以直接用于PCR或qPCR。鏈cDNA合成反應混合物的體積不應超過總PCR反應體積的1/10。通常2μL的鏈cDNA合成反應混合物用作后續(xù)總體積為50μLPCR的模板中。應使用陽性和陰性對照反應來驗證鏈cDNA合成步驟的結果。逆轉錄酶陰性對照(RT-)在RT-PCR或RT-qPCR反應中很重要，用于評估RNA樣品的基因組DNA污染。對照組(RT-)反應包含除逆轉錄酶外的所有逆轉錄反應試劑。無模板陰性對照(NTC)對于評估試劑污染也非常重要，NTC反應包含除RNA模板外的逆轉錄反應的所有試劑。陽性對照RNA模板和基因特異性引物隨本試劑盒一起提供。通過體外轉錄產生人GAPDH 對照RNA(1.3kb)，設計的GAPDH特異性PCR引物與人、小鼠和大鼠的GAPDH基因互補，并能擴增出496bp的RT-PCR產物。陽性對照的RT-PCR的方案如下。

解凍后，將試劑盒的各組分短暫離心，在冰上儲存。

1. 按順序將以下試劑加入冰上無菌、無核酸酶的PCR管中。

2. 輕輕攪拌并離心。

3. 對于使用oligo(dT)₁₈ primer或Reverse GAPDH Primer 的cDNA合成，在42℃孵育60分鐘。對于使用Random Hexamer primer的cDNA合成，在25℃下孵育5分鐘，然后在42℃下溫育60分鐘。  

4. 在70℃下加熱5分鐘終止反應。短暫離心，然后繼續(xù)進行PCR擴增。

5. 將對照組鏈cDNA合成的產物在無核酸酶的水中以1:1000稀釋。

6. 所有的PCR試劑解凍后，輕輕渦旋并短暫離心。

7. 將薄壁PCR管放在冰上，加入以下試劑。

8. 在帶有加熱蓋的PCR儀中進行PCR反應。

9.將5-10μL RT-PCR產物點入1%瓊脂糖凝膠里。電泳后經溴化乙錠染色，應可見明顯的496bp的PCR產物。

1、應避免核糖核酸酶污染，RNA的純度和完整性對于全長cDNA的合成至關重要。RNA可以被RNase A降解，RNase A是一種在任何實驗室環(huán)境中都能發(fā)現的高度穩(wěn)定的污染物。  

2、DEPC處理所有用于cDNA合成的PCR管和槍頭，或使用經過認證的無核酸酶實驗室用品。

3、處理RNA和所有試劑時戴手套，因為皮膚是RNA酶的常見來源。經常更換手套。

4、使用無核酸酶的水或者DPEC水，使用試劑盒里的RiboLock RNase Inhibitor (20 U/μL)保護RNA免受RNase活性的影響。不使用時，保持所有試劑盒組分密封。在逆轉錄反應過程中，保持所有PCR管蓋緊。

5、RNA純化方案中使用的試劑可能留在溶液中并抑制鏈cDNA的合成，例如SDS、EDTA、胍鹽、磷酸鹽、焦磷酸鹽、多胺、亞精胺等。為了去除污染物，用乙醇重新沉淀RNA，并用75%乙醇洗滌沉淀物。

6、使用與RNA模板匹配的正確引物。細菌RNA或沒有poly(a)尾部的RNA模板用Random Hexamer primer替代Oligo(dT)18 primer，確保序列特異性引物與模板RNA的3'端互補。

7、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

8、本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究使用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。