蛋白Marker—即蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，是一些已知分子量的蛋白質(zhì)的混合物，像“尺子”一樣用來指示蛋白條帶所對應(yīng)的分子量大小。此外，蛋白Marker還有表示蛋白轉(zhuǎn)移成功或蛋白在凝膠上的電泳程度等作用。本期我們就來介紹一下蛋白marker的分類、選擇及遷移率。蛋白Marker主要分為未預(yù)染蛋白Marker和預(yù)染蛋白Marker兩種，另外還有一些其他類型的蛋白Marker：如顯影蛋白Marker等。未預(yù)染蛋白Marker：是幾種已知分子量并純化好的蛋白質(zhì)預(yù)混液。非預(yù)染蛋白Marker在電泳過程中看不到，電泳結(jié)束后經(jīng)過蛋白染色后才能起指示作用，無法在實驗過程中起預(yù)示作用。但是由于蛋白沒有附帶染料分子或者是標(biāo)記分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，所以準(zhǔn)確。預(yù)染蛋白Marker：是純化好的幾種蛋白，通過與染料共價耦聯(lián)后混合在一起，在電泳過程中或者轉(zhuǎn)膜時可以直接觀察到的一種蛋白Marker。預(yù)染蛋白Marker又可分為單色預(yù)染和多色預(yù)染。Marker條帶越多參考價值越大，同時也越難區(qū)分，若用不同顏色則容易辨認(rèn)；單色的Marker通常利用其中某些條帶加倍濃度來提示其大小。預(yù)染蛋白Marker在電泳過程可以起到預(yù)示作用，當(dāng)觀察目標(biāo)蛋白大小位置進(jìn)入佳分辨區(qū)時，停止電泳，以得到佳分辨效果。轉(zhuǎn)膜過程可以監(jiān)測轉(zhuǎn)膜效率，同時可以在膜上標(biāo)記蛋白分子量。但是，預(yù)染蛋白Marker與染料共價偶聯(lián)，在不同的緩沖條件下，電泳遷移特性可能會發(fā)生某些變化，導(dǎo)致一些偏差。也就是說，預(yù)染蛋白Marker條帶代表的是相對大小，而不是絕對大小。顯影蛋白Marker：顯影蛋白Marker，蛋白條帶中含有IgG結(jié)合位點，IgG結(jié)合位點會結(jié)合用于檢測靶蛋白的一抗或二抗，使得蛋白Marker在印跡膜上可與目的條帶一同呈現(xiàn)。通常會有兩個預(yù)染條帶，便于動態(tài)觀察蛋白質(zhì)電泳狀態(tài)，判斷轉(zhuǎn)膜效果和方向；結(jié)合抗體后經(jīng)化學(xué)發(fā)光檢測可顯示多個條帶。首先明確自己實驗?zāi)康?，如果只需要電泳后觀察蛋白條帶大小，或精確蛋白分子量，又或者需要區(qū)分大小相近的條帶，可以選用非預(yù)染蛋白Marker。如果做WB實驗，可以選擇預(yù)染蛋白Marker，這樣可以實時觀察到電泳、轉(zhuǎn)膜情況。選擇合適的預(yù)染蛋白Marker呢？可以從以下方面進(jìn)行考慮：蛋白Marker又分為高分子量、低分子量、寬分子量幾類。檢測大分子量蛋白經(jīng)常使用到高分子量范圍Marker，檢測小蛋白甚至是一些多肽常會用到小分子量范圍Marker。如果從整個實驗室考慮，選寬分子量、條帶分布比較均勻的Marker，這樣你的蛋白無論在哪個區(qū)間都容易判斷。
不同分子量蛋白Marker
2、條帶準(zhǔn)確性：預(yù)染蛋白Marker，染料的標(biāo)記反應(yīng)和蛋白質(zhì)的其它標(biāo)記反應(yīng)一樣，其實際標(biāo)記效率由于各種各樣的因素而波動于一個合理的區(qū)間，不是一個確定的常數(shù)。在預(yù)染蛋白Marker的生產(chǎn)過程中，染料標(biāo)記效率的波動將直接影響到終標(biāo)記產(chǎn)物的分子量大小。因此廠商都有一套優(yōu)化的條件來實現(xiàn)相對穩(wěn)定的染料標(biāo)記效率。即使如此，標(biāo)記效率的穩(wěn)定性仍然不可能達(dá)到一個穩(wěn)定的常數(shù)，僅能將其控制在一個比較小的波動范圍。其結(jié)果是，染料標(biāo)記的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分子量在不同批次間會存在一定的波動。這就是我們俗稱的分子量準(zhǔn)不準(zhǔn)的問題。由上述原理可知，沒有哪家公司的預(yù)染蛋白Marker具有絕對的準(zhǔn)確性。正如Thermo在其產(chǎn)品說明書中明確寫道，預(yù)染蛋白Marker僅用作為蛋白質(zhì)分子量的近似參考，不同批次產(chǎn)品間具有不大于5%的批間差異。不同的蛋白質(zhì)（不考慮修飾） ，即使分子量相同，也有可能（比例較?。┯捎诎被峤M成的不同等因素，而表現(xiàn)出泳動遷移率的差異。實踐中，這種看起來似乎不符合電泳原理情況常常會出現(xiàn)，相信做實驗比較多的小伙伴可能也曾遇到過。3、穩(wěn)定性：偶聯(lián)染料是否容易脫落，使條帶顏色變淺，Marker是否易降解。4、與膜的親和性：轉(zhuǎn)到膜上因為要經(jīng)過多次洗膜，長時間孵育，所以蛋白Marker與膜的親和性也很重要。我們有時候會觀察到同一種蛋白Marker會出現(xiàn)分子量不同的情況，或者是實驗時發(fā)現(xiàn)目的蛋白參照Marker時分子量好像不正確，或是出現(xiàn)蛋白Marker小條帶消失等問題，這很有可能是因為跑膠時緩沖體系和凝膠濃度選擇不當(dāng)。當(dāng)相同的蛋白質(zhì)在不同的SDS-PAGE緩沖系統(tǒng)（如 Bis-Tris 和 Tris-甘氨酸）中運行時，蛋白質(zhì)的遷移率會產(chǎn)生輕微差異。每種 SDS-PAGE 緩沖系統(tǒng)均具有不同的 pH 值，因而會影響蛋白質(zhì)的電荷及其與 SDS 的結(jié)合能力。蛋白質(zhì)遷移率的變化程度在天然蛋白質(zhì)中通常很小，但對于非典型或化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)，如預(yù)染蛋白Marker，其變化更為明顯。所有預(yù)染蛋白Marker的表觀分子量都會因緩沖條件的不同而發(fā)生變化，所以應(yīng)根據(jù)所用緩沖體系使用相匹配的表觀分子量，來更準(zhǔn)確地定位目標(biāo)蛋白。同一種預(yù)染蛋白Marker在同一種緩沖體系、不同膠濃度的遷移率也是不一樣的。實驗時應(yīng)當(dāng)選擇合適的膠濃度，以保證蛋白Marker條帶分離清晰，且條帶不會跑出凝膠。同種預(yù)染蛋白Marker在不同凝膠濃度下以及不同電泳條件下的分子量分布圖Q1：使用預(yù)染蛋白Marker有哪些注意事項？A：1）由于預(yù)染的蛋白Marker與染料的偶聯(lián)作用導(dǎo)致在不同緩沖液中Marker遷移率不同，使用前需注意選擇適當(dāng)緩沖體系。若使用說明書中未涉及的電泳緩沖液，建議用非預(yù)染蛋白Marker對該預(yù)染蛋白Marker先進(jìn)行分子量標(biāo)定；3）大分子量蛋白Western blot時需要延長轉(zhuǎn)膜時間或加高轉(zhuǎn)膜電壓。Q2：預(yù)染蛋白Marker能否被考馬斯亮藍(lán)染色？A：有些預(yù)染Marker可以被考馬斯亮藍(lán)染色，有些不可以。原因：考馬斯亮藍(lán)含有偏酸性的基團(tuán)，如R-250分子中，含有兩個-HSO3，酸性基團(tuán)可以結(jié)合到蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)上，從而使得蛋白染上顏色，蛋白量越高，顏色越深。預(yù)染蛋白Marker為不同大小的蛋白和染料共價結(jié)合，根據(jù)染料的不同，結(jié)合蛋白質(zhì)的位置也不同，如果Marker上染料結(jié)合了考馬斯亮藍(lán)結(jié)合基團(tuán)，則不能夠再次結(jié)合考馬斯亮藍(lán)去染色。否則考馬斯亮藍(lán)能夠結(jié)合可以染色。Q3：做WB實驗時，預(yù)染蛋白Marker條帶也曝光，為什么？A：預(yù)染蛋白Marker是由重組蛋白組成，可能所使用的蛋白Marker含有His標(biāo)簽。若一抗使用的是his標(biāo)簽，二抗除了跟帶his標(biāo)簽的一抗結(jié)合外，還會跟帶His標(biāo)簽的蛋白Marker條帶結(jié)合，因此，加入ECL發(fā)光液后，蛋白Marker和樣品中目的蛋白一同曝光。Q4：預(yù)染蛋白質(zhì)Marker在轉(zhuǎn)印過程中條帶在膜上褪色？A：褪色可能是由于封閉/洗滌液中的洗滌劑將一些蛋白質(zhì)從膜上洗脫造成的。染料本身不會從蛋白質(zhì)上洗脫，因為它們是共價結(jié)合的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)較小孔徑的膜可以在封閉和洗滌過程中更好地保留蛋白質(zhì)，因此，為了獲得絕佳的分辨率和蛋白質(zhì)保留率，推薦使用0.2 μm代替0.45 μm的膜。轉(zhuǎn)印后，可以用鉛筆在膜上圈出預(yù)染條帶，從而在封閉和處理后仍可辨認(rèn)條帶位置。Q5：使用蛋白Marker轉(zhuǎn)印時，小分子蛋白質(zhì)條帶穿過了膜，為什么？A：1）降低電壓、電流或縮短轉(zhuǎn)印時間；2）確保轉(zhuǎn)膜緩沖液的甲醇濃度合適；可使用濃度為10–20%的甲醇，一般推薦15%，從而去除SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物中的SDS，并促進(jìn)蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合。甲醇濃度太高易造成蛋白穿膜，轉(zhuǎn)移到濾紙上；3）確保轉(zhuǎn)膜緩沖液的SDS濃度合適(若加入了SDS)，SDS濃度不要超過0.02–0.04%。過多的SDS會阻礙蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合；4）檢查膜的孔徑和靶標(biāo)蛋白質(zhì)的大小。小于10 KD的蛋白質(zhì)很容易穿過0.45μm孔徑的膜。如果目標(biāo)蛋白質(zhì)小于10 KD，建議使用0.2μm孔徑的膜。Q6：電泳后蛋白Marker條帶不完全（條帶缺失或無法分離）？A：1）檢查使用的凝膠類型及凝膠百分比。建議在推薦的凝膠濃度范圍內(nèi)使用。此外，放置時間較長的蛋白膠和緩沖液也會造成電泳效果欠佳；2）檢查蛋白Marker的有效日期。過期可能由于蛋白質(zhì)降解導(dǎo)致條帶褪色或缺失，通常蛋白Marker可在-20℃條件下儲存一年，4℃可放置2個月；3）儲存不當(dāng)。不當(dāng)?shù)膬Υ鏃l件會損害其中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，蛋白Marker應(yīng)置于-20℃儲存，低溫運輸；4）使用的Marker體積過大。建議按說明書推薦量添加；5）確保蛋白Marker在上樣到凝膠上之前未加熱或煮沸。通常蛋白Marker可直接上樣，不建議將其加熱或煮沸，因為這可能會導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)品中的蛋白質(zhì)降解；6）環(huán)境中存在蛋白酶污染。酶可降解大分子量Marker，由于Marker、凝膠、緩沖液、移液管或儀器在使用過程中可能受到蛋白酶的污染，建議避免在同一個房間使用蛋白酶，準(zhǔn)備新的溶液，清潔儀器，使用干凈的移液管和槍頭。若Marker本身受到污染，請使用新的蛋白Marker。Q7：實驗時目的蛋白參照蛋白Marker，與預(yù)期大小不符，是什么原因？A：1）預(yù)染蛋白Marker本身的準(zhǔn)確性和遷移率的問題。可用非預(yù)染蛋白Marker進(jìn)行校準(zhǔn)；根據(jù)所用緩沖液體系使用相匹配的表觀分子量，來更準(zhǔn)確地定位目的蛋白；2）SDS-PAGE凝膠電泳按照分子量大小將蛋白分離，是蛋白在充分變性、還原條件下，使蛋白分子帶上均勻密度負(fù)電荷，蛋白分子的形狀是短軸一樣的鏈狀結(jié)構(gòu)（單條肽鏈）來實現(xiàn)的。如果蛋白樣品未充分變性、還原，其形狀和電荷等因素會影響遷移率從而導(dǎo)致分子量與預(yù)期不符合。Q8：蛋白質(zhì)電泳蛋白Marker呈“啞鈴型條帶”或“微笑型條帶”？A：1）上樣量過多。建議按照說明書使用恰當(dāng)?shù)纳蠘芋w積；2）分離膠表面不平。建議采用乙醇壓平分離膠表面達(dá)到水平效果；3）凝膠過期。建議提前配好的凝膠于4℃用緩沖液浸泡保存，一周內(nèi)使用；4）膠未完全混勻易導(dǎo)致部分條帶正常，部分條帶“微笑型”。建議重新制備。
A：1）如在凝膠兩側(cè)泳道，由于邊緣效應(yīng)、離子強度不均等原因，均會導(dǎo)致帶型變寬或彎曲，建議點樣時將蛋白樣品點在泳道中間；
2）凝膠配制不勻，凝膠內(nèi)存有氣泡，配膠時凝固時間不夠?qū)е履z沒有凝完全，或點樣孔中有細(xì)碎的殘膠；
3）電泳儀問題或者緩沖液沒有溶解均勻，導(dǎo)致電壓不穩(wěn)定。
