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增強型BCA蛋白定量試劑盒的原理是蛋白質(zhì)分子中肽鍵結(jié)構(gòu)在堿性條件下將二價銅離子還原為一價銅離子，一價銅離子與BCA分子形成紫色絡(luò)合物。此絡(luò)合物可用540-590nm波長檢測 ，并在562nm處有大的光吸收值。反應(yīng)物的顏色和蛋白質(zhì)濃度在一定范圍內(nèi)具有線性關(guān)系，故可以根據(jù)吸光度值的大小來測定蛋白的含量。該方法快速靈敏、穩(wěn)定可靠，對不同種類蛋白質(zhì)檢測的變異系數(shù)非常小，倍受專業(yè)人士青睞。

BCA法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，在組織細胞裂解實驗中，對于5%濃度以內(nèi)的去垢劑SDS，TritonX-100，Tween20，Tween80具有很好兼容性，但易受螯合劑(EDTA，EGTA)、還原劑(DTT、巰基乙醇)和脂類的影響。本試劑盒含有一系列濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(BSA溶液)，即取即用，無需稀釋，方便快捷。

在0.02-2mg/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

BCA工作液配制：

將試劑A和試劑B按照體積比50: 1比例混合，配成BCA工作液，充分混勻。工作液總量= (BSA標(biāo)準(zhǔn)品樣本個數(shù)＋待測樣本個數(shù))×200ul）。新配制的BCA工作液室溫密封條件下可穩(wěn)定保存24h。

操作說明:

一、微孔板測定程序:

1、分別取8個濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)品各20μl加到96孔板中( BSA標(biāo)準(zhǔn)品使用前須充分溶解搖勻)。

2、用1*PBS或0.9%生理鹽水將蛋白樣品適當(dāng)稀釋(如5倍、10倍、20倍稀釋)，加20ul到96孔板的樣品孔中。

3、向96孔板中的各孔加入200ul BCA工作液，充分混勻，37℃孵育30分鐘，冷卻置室溫。

注：也可以室溫放置2小時，或60℃放置30分鐘。BCA法測定蛋白濃度時，顏色會隨著時間的延長不斷加深，并且顯色反應(yīng)會因溫度升高而加快。如果蛋白濃度較低，可在較高溫度孵育，或適當(dāng)延長孵育時間。

4、 用酶標(biāo)儀測定562nm處的吸光值并記錄讀數(shù)； 以BSA標(biāo)準(zhǔn)品(0ug/ml)的吸光值作為空白對照。

5、 以A562為縱坐標(biāo)，BSA含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中的蛋白濃度。如果所得到的蛋白濃度不在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，請稀釋樣品后重新測定。

注：數(shù)據(jù)處理時需要去除明顯錯誤的值，并減去空白對照的吸光度。待測樣品濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得， 實際濃度需要乘以樣品的稀釋倍數(shù)。

二、試管測定程序:

1、分別取8個濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)品各100ul加到試管中( BSA標(biāo)準(zhǔn)品使用前須充分溶解搖勻)。

2、用1*PBS或0.9%生理鹽水將蛋白樣品適當(dāng)稀釋(如5倍、10倍、20倍稀釋)，加100ul到試管中。

3、向試管中加入2ml BCA工作液，充分混勻，37℃孵育30分鐘，冷卻置室溫。

4、5步驟同上。

1、BCA試劑在低溫條件下出現(xiàn)結(jié)晶沉淀時，可37℃溫浴使其溶解，不影響使用。

2、待測蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品也宜溶解于什么樣的稀釋液中，否則待測蛋白與蛋白標(biāo)準(zhǔn)品中所含非蛋白成分不一致 ，有可能導(dǎo)致測定不準(zhǔn)確。

3、建議每次測定時都做標(biāo)準(zhǔn)曲線。因為BCA法測定時顏色會隨著時間的延長不斷加深，并且顯色反應(yīng)的速度和溫度有關(guān)，所以除非精確控制顯色反應(yīng)的時間和溫度，否則如需精確測定需每次都做標(biāo)準(zhǔn)曲線。要想得到更為精確的蛋白濃度結(jié)果，建議每個蛋白標(biāo)曲梯度和樣品均做復(fù)孔。

4、如發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身就有較高背景，請試用Bradford 蛋白定量試劑盒(PMK0443)。

5、本試劑盒受螯合劑和略高濃度的還原劑影響，需確保EDTA低于10mM，無EGTA，二硫蘇糖醇(DTT)低于1mM，β-巰基乙醇低于50uM，不適用BCA法時建議試用Bradford蛋白定量試劑盒(PMK0443)。

6、如果沒有酶標(biāo)儀，也可以使用普通的分光光度計測定，但測定時需根據(jù)比色皿的小檢測體積，按比例適當(dāng)加大BCA工作液的用量使總體積不小于小檢測體積，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的用量亦相應(yīng)按比例放大。使用分光光度計測定蛋白濃度時 ，每個試劑盒可以測定的樣品數(shù)量可能會顯著減少。

7、本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

8、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。