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菁染料是性能優(yōu)良的熒光標(biāo)記染料，摩爾吸光系數(shù)在熒光染料中是高的，其琥珀酰亞胺酯是常用的脂肪氨基標(biāo)記試劑，廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標(biāo)記和檢測(cè)。通過(guò)改變次甲基鏈的長(zhǎng)度,?可改變其熒光發(fā)射波長(zhǎng)，每增加一個(gè)雙鍵，按照Huoffman規(guī)則正好紅移約100nm。

菁染料Cy3和Cy5已成為基因芯片的首選熒光標(biāo)記物；另外，Cy5， Cy5.5和Cy7的吸收在近紅外區(qū)背景非常低，是熒光強(qiáng)度高、穩(wěn)定的長(zhǎng)波長(zhǎng)染料。特別適合于活體小動(dòng)物體內(nèi)成像代替放射性元素。

菁染料和生物分子的比例F/P=4～12之間熒光強(qiáng)度高，F(xiàn)/P值過(guò)高熒光探針會(huì)自我淬滅并影響生物分子的生物活性，標(biāo)記生物分子好是用單琥珀酰亞胺酯，但是用雙修飾的CyDye NHS并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)交聯(lián)。CyDye NHS標(biāo)記抗體在pH (8.5～9.4)時(shí)10分鐘F/P可達(dá)5～6，而在pH 7.0幾乎不反應(yīng)。用不同比例的Cy3標(biāo)記anti-glutathione-S-transferase (GST)多克隆抗體發(fā)現(xiàn)用1:1, 5:1, 10:1?和20:1標(biāo)記時(shí)得到的F/P值分別是0.28:1, 1.16:1, 2.3:1?和4.6:1。

水溶性SulfoCy3 NHS標(biāo)記anti-GST多克隆抗體

市場(chǎng)上買(mǎi)到的抗體如果含有其它蛋白或帶氨基的緩沖液會(huì)影響標(biāo)記，在標(biāo)記前需純化。

1.?在1L 0.15 MNaCl?溶液中透析anti-GST抗體(濃度為0.5 mL at 3 mg/mL)，常溫透析4小時(shí)。

2.?在4°C用新鮮的1L 0.15M NaCl?溶液再透析過(guò)夜。

3.?第二天用1L 0.1M NaHCO₃(pH 8.3)透析4小時(shí)。

4.?用0.22μm注射器過(guò)濾頭過(guò)濾抗體溶液。

5.?用0.1M NaHCO₃稀釋少量的抗體，在280nm處測(cè)其紫外吸收值計(jì)算標(biāo)記抗體的總量（IgG antibody摩爾吸光系數(shù)170 000 M-1cm-1at 280nm).?

6.?用無(wú)水DMSO配置Cy3 NHS (MW 765.95)溶液濃度為10 mg/mL；計(jì)算所需體積以得到想要的CyDye NHS?和抗體的比值(例如20:1)，然后慢慢將其加入到抗體溶液中，同時(shí)在暗處常溫緩慢攪拌45分鐘。

7.?用1L 0.15M NaCl?溶液常溫避光透析4小時(shí)除去未標(biāo)記上的Cy3。

8.?在4°C用新鮮的1L 0.15M NaCl?溶液再避光透析過(guò)夜。

9.?用1L of 0.01M PBS/ 0.01%?疊氮化鈉溶液常溫避光透析4小時(shí),?在4°C常溫避光再次透析過(guò)夜。

10.?用0.22μm注射器過(guò)濾頭過(guò)濾抗體溶液。

11.?用0.01M PBS/0.01 %?疊氮化鈉整數(shù)倍稀釋標(biāo)記抗體溶液，測(cè)量280nm（蛋白）和552nm（Cy）處的紫外可見(jiàn)吸光度。

12.?產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在0.01M PBS/ 0.01%?疊氮化鈉溶液中，-20℃避光儲(chǔ)存。

SulfoCy3 在552nm摩爾吸光系數(shù)為150 000 M-1cm-1；此蛋白在280nm的摩爾吸光系數(shù)為170 000 M-1cm-1；不同蛋白的摩爾吸光系數(shù)不一樣；Cy3?染料本身在280nm的吸收是552nm處的8%。按以下公式計(jì)算F/P值。

[Cy3] = A552/150000

[antibody] = {A280- (0.08×A552)}/170000?

F/P?final= [Cy3]/[antibody]= {1.13×A552}/ {A280- (0.08×A552)}