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Cy5.5-N-羥基琥珀酰亞胺酯，水溶性菁染料是性能優(yōu)良的熒光標(biāo)記染料, 具有很好的水溶性和很高的摩爾吸光系數(shù)，其琥珀酰亞胺酯是常用的脂肪氨基標(biāo)記試劑，廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標(biāo)記和檢測(cè)。特別是Cy5.5和Cy7的吸收在近紅外區(qū)，已廣泛用于活體成像領(lǐng)域來(lái)代替放射性元素。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)血紅蛋白是吸收可見(jiàn)光的主要成分, 能吸收中藍(lán)綠光波段的大部分可見(jiàn)光; 水和脂質(zhì)主要吸收紅外線，因此選擇激發(fā)和發(fā)射光譜位于650nm-900nm(近紅外窗口)的近紅外熒光標(biāo)記的紅光雖然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳動(dòng)物組織被敏感的CCD檢測(cè)到，更有利于活體光學(xué)成像，特別是深層組織的熒光成像。

Cy5.5 NHS標(biāo)記IgG

1. 標(biāo)記前注意事項(xiàng)：本標(biāo)記方案僅供參考，使用時(shí)請(qǐng)根據(jù)自己的抗體適當(dāng)修改。待標(biāo)記的抗體或蛋白等物質(zhì)，不能含有BSA, gelation, free amino acid and ammonium salt等. 這些雜質(zhì)參與標(biāo)記反應(yīng)，需要純化掉這些雜質(zhì)后才能標(biāo)記。

2. 標(biāo)記需要的器材和試劑：

Cy5.5 NHS； IgG抗體，1M NaHCO₃溶液， PBS緩沖液pH=7.2～7.4； 1M NaOH或者1M HCl

Sephadex G-25凝膠層析柱，聚丙烯酰胺凝膠填料或其它脫鹽柱。 

3. 將1mL 10mg/mL IgG抗體（約0.0667mM）用NaHCO₃平衡到pH=8.5～9.5, 然后分四次加入現(xiàn)配現(xiàn)用的Cy5.5 無(wú)水DMSO溶液，每次100uL每次間隔10min。 （1mg Cy5.5 NHS溶在100uL無(wú)水DMSO中）

4. 抗體和染料的混合液在常溫充分?jǐn)嚢?h后純化。

5. 用Sephadex G-25凝膠層析柱，聚丙烯酰胺凝膠填料純化標(biāo)記后的抗體，PBS緩沖液pH=7.2～7.4作為洗脫液，收集收集適當(dāng)?shù)纳珟Х濉?/span>

6. 產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光儲(chǔ)存；必要時(shí)可用質(zhì)譜表征。

7. 標(biāo)記的蛋白穩(wěn)定性取決于蛋白本身。例如標(biāo)記的IgG在4℃可避光保存2月；更長(zhǎng)期的保存需加入等體積的甘油-20℃避光保存。

Cy5.5 NHS標(biāo)記 (D-ser2)-leucine enkephalin

1. Cy5.5 NHS 1.0 mg 溶解于400 μL DMSO后，加入到1mL 的玻璃瓶中盛有(D-ser2)-leucine-enkephalin acetate (YSGFLT, 0.75 mg) 的400 μL DMSO溶液。（Dye 和peptide 投料比是 1:1）

2. 然后加入15 μL三乙胺，常溫避光攪拌反應(yīng)混合物過(guò)夜。

3. 用HPLC 純化蛋白，使用蛋白C18柱子(25 cm×10 mm)，每次上樣注入2×400 μL，30分鐘梯度洗脫從0.1% TFA水溶液到MeCN∶H2O（0.1% TFA）=70∶30，流速4mL /min。（對(duì)不同的蛋白選擇不同的合適HPLC梯度流動(dòng)相）

4.  收集適當(dāng)?shù)纳珟Х澹瑯?biāo)記多肽的保留時(shí)間比未標(biāo)記的多肽長(zhǎng)。

5.  產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光儲(chǔ)存；必要時(shí)可用質(zhì)譜表征。

6. CyDye標(biāo)記的蛋白穩(wěn)定性取決于蛋白本身。例如標(biāo)記的IgG在4 ℃可避光保存2月；更長(zhǎng)期的保存需加入等體積的甘油-20 ℃避光保存。