日韩大片一卡2卡3卡4卡5卡二-亚洲а∨天堂男人色无码-色偷偷久久一区二区三区-日韩不卡在线中文一区

NADPH 氧化酶（NAO）廣泛存在于動物、植物和真菌中，是一個典型的膜蛋白，催化NADPH氧化生成NADP+，并將電子傳遞給氧原子從而產(chǎn)生超氧陰離子。該酶異常可導致人慢性肉芽腫病（GCD），在植物中，該酶與其抗病性和各種脅迫有密切關系。本試劑盒提供了一種簡單的檢測方法檢測生物樣本中NADPH 氧化酶（NAO）的活性水平。其原理是NADPH 氧化酶（NAO）將 NADPH氧化為NADP+，NADPH在340nm有特征吸收峰，而 NADP+沒有；通過測定 340nm吸光度減少的速率來計算得出NAO酶活性大小。

酶標儀或紫外分光光度計（能測340nm處的吸光度）

96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可調節(jié)式移液槍及槍頭

恒溫箱、制冰機、低溫離心機

去離子水

勻漿器（如果是組織樣本）

提取液：即用型；4℃保存。

反應緩沖液：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。

試劑一：臨用前配制；用前96T加入5mL去離子水，48T加入2.5mL去離子水，未用完試劑分裝-20℃保存，實驗時冰上放置，避免反復凍融。

動植物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mL預冷的提取液，冰浴勻漿，12,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。

細胞：收集5×10⁶個細胞，用冷PBS清洗細胞后棄上清，加入1mL預冷的提取液冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次）。12,000g，4℃，離心10min，取上清，置冰上待測。

血清、血漿等液體樣本：可直接測定，根據(jù)預實驗確定稀釋倍數(shù)。

注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個月。如需測定蛋白濃度，推薦使用BCA蛋白質定量試劑盒進行樣本蛋白質濃度測定。

1．酶標儀或可見分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長到340nm，可見分光光度計去離子水調零。

2．反應緩沖液置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）預熱15min。

3．樣本測定：在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入10μL樣本，150μL反應緩沖液和40μL試劑一。充分混勻，記錄340nm處1min 20s時吸光值A₁，迅速放入25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）恒溫箱中，準確反應 5min。迅速取出記錄6min 20s時的吸光度 A₂。計算ΔA=A₁-A₂。

注意：1.實驗之前建議選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預實驗。如果ΔA小于0.001可延長反應時間T（如至10min或更長），或適當加大樣本量；注意對計算公式進行調整。如果ΔA大于1.0，可用提取液稀釋樣品，計算時結果乘以稀釋倍數(shù)。

2. 測定反應的溫度對測定結果有影響，請控制在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）。

3. 因通過反應速率計算酶活，使用96孔板時請根據(jù)操作速度控制一次測定的樣本數(shù)（通常一次測定4-8個樣本）。

NAO活力單位的計算

A. 使用96孔板測定的計算公式

1. 按樣本鮮重計算

活力單位定義：一定條件下，每g樣品在反應體系中每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。

6PGDH（U/g 鮮重）=[△A×V_反總÷(ε×d)×10⁹]÷(V_樣÷V_樣總×W)÷T=1286×ΔA÷W

2. 按液體體積計算

活性單位定義：一定條件下，每mL液體樣本在反應體系中每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。6PGDH(U/mL)=[△A×V_反總÷(ε×d)×10⁹]÷V_樣÷T=1286×ΔA

3. 按細胞數(shù)量計算

活力單位定義：一定條件下，每10⁴個細胞或細菌在反應體系中每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。

6PGDH(U/10⁴ Cells)=[△A×V_反總÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V_樣÷V_樣總)÷T=1286×△A÷500=2.572×△A

（4）按蛋白濃度計算

活力單位定義：一定條件下，每毫克蛋白在反應體系中每分鐘催化1nmol NADPH氧化為1個酶活單位。

6PGDH(U/mg prot)=[△A×V_反總÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V_樣)÷T=1286×△A÷Cpr

ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V_反總：反應體系總體積，200μL=2×10^-4 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；V_樣：加入反應體系中樣本體積，10μL =0.01mL；V_樣總：提取液體積，1mL；Cpr：上清液蛋白濃度mg/mL；W：樣品質量，g；T：反應時間，5min；500：細胞數(shù)量，500萬。

B. 使用微量石英比色皿進行測定的計算公式

將上述計算公式中光徑 d：0.5cm 調整為 d：1cm 進行計算即可。