極超敏 ECL 發(fā)光底物檢測試劑盒用于檢測直接或間接標記辣根過氧化物酶 HRP 的抗體及其關(guān)聯(lián)的抗原，是一種可廣泛應用于免疫學實驗的化學發(fā)光試劑。由于采用了獨特的發(fā)光底物系統(tǒng)和高靈敏度熒光 ECL 發(fā)光試劑，極超敏 ECL 發(fā)光底物檢測試劑盒是目前靈敏的商業(yè)化熒光 ECL 檢測試劑之一，靈敏度高于常規(guī)超敏ECL 檢測試劑數(shù)千倍乃至數(shù)萬倍：
(1) 具有極高靈敏度和高信噪比，可檢測 10～100ag 微量抗原；
(2) 發(fā)光迅速且穩(wěn)定，熒光可使 X 光膠片感光達 12 小時以上，特別適用于痕量蛋白或核酸檢測；
(3) 可使用更高的抗體稀釋倍數(shù)(1:2000～1:20000) ，極其節(jié)省抗體。
(4)優(yōu)異的性價比，更高的性能，更低的價格。
(1) 使用合適的方法進行 Western Blot ，直至用 PBST 洗滌二抗。注意用 HRP 標記 IgG 或用一抗-鏈親和素-生物素-HRP 夾心法。
(2) Western Blot 后一次洗膜的同時新鮮配制發(fā)光工作液：分別取等體積的溶液 A 和 B ，放入干凈容器中混合備用。工作液宜在臨檢測前配制，室溫放置數(shù)小時后仍可使用但靈敏度略有降低。
(3) 用 WB 專用鑷子取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液但勿使膜完全干燥。將膜置于一潔凈保鮮膜上，然后使其 完全浸入新配制的發(fā)光工作液(0. 1mL 發(fā)光工作液/cm2 膜)中充分接觸，室溫孵育 2 分鐘。孵育時間過長不會 增加靈敏度，有時還會導致曝光條帶異常。發(fā)光過程的本質(zhì)是酶促反應，使用過少的發(fā)光工作液不利反應進行，也會導致膜上條帶曝光不均和明顯的靈敏度降低，為達節(jié)約目的可將膜剪小但勿降低發(fā)光液用量。
(4) 用 WB 專用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發(fā)光工作液，但勿洗去發(fā)光液。將膜放在兩片保鮮膜中間，隨后進行壓片檢測或化學發(fā)光成像儀檢測。
(5) 壓片檢測：將 Western Blot 膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來完全包裹 Western Blot 膜，去除氣泡和皺 褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。將覆蓋 Western Blot 膜的保鮮膜固定在暗 盒內(nèi)，蛋白帶面向上。打開 X 光膠片暗盒，暗房內(nèi)壓 X 光膠片，分別曝光不同的時間如數(shù)秒到數(shù)分鐘，然后定影顯影沖洗。后根據(jù)結(jié)果再調(diào)整壓片時間得到滿意的壓片結(jié)果。
(6) 化學發(fā)光成像儀檢測：將膜放置到化學發(fā)光成像儀內(nèi)，參考儀器說明書進行檢測。
(1) 各溶液使用完后，請蓋緊瓶蓋以防失效。特別是 B 液，含有氧化劑，比較容易被還原而失效。
(2) A 液和 B 液在吸取過程中必須要更換槍頭，A 液和 B 液相互污染后會導致 A 液和 B 液逐漸失效，影響后續(xù)的使用效果。
(3) 步驟 1～4 可在日光燈下操作；但發(fā)光液曝露于強光下時間過久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。
(4) 長時間曝光或蛋白過量，將加深背景并使條帶強弱變化失去線性關(guān)系；曝光不足則條帶模糊。
(5) 發(fā)光工作液孵育約 2 分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見，低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚 至肉眼不可見但可使 X 光膠片曝光。不能簡單以肉眼觀察判斷條帶發(fā)光時間，肉眼不可見的熒光實際上可持續(xù)數(shù)小時并使 X 光膠片感光，因而弱帶可曝光 1- 10 小時。
(6) 由于極超敏發(fā)光液極其靈敏，強烈推薦大多數(shù)進口抗體起始濃度為一抗 1:2000～1:20000 ，二抗 1:10000~1:100000 。抗體濃度過高將造成高背景或沒有條帶導致失敗。
(7) 當發(fā)現(xiàn)極超敏 ECL 發(fā)光底物檢測試劑盒(PMK0575)的檢測靈敏度過高而影響檢測結(jié)果時，可以選擇檢測靈敏度較低一些的特超敏 ECL 發(fā)光底物檢測試劑盒(PMK003)或超敏 ECL 發(fā)光底物檢測試劑盒(PMK0448)，或者減少樣品、一抗或二抗的用量。
(8) 某些保鮮膜包裹印跡膜時可能會淬滅熒光，應選擇高質(zhì)量保鮮膜。盡量使用 WB 專用鑷子或者塑料鑷子，金屬鑷子可能會造成淬滅熒光。
(9) NaN3 能抑制 HRP 活性，因此緩沖液中應避免使用 NaN3 做為防腐劑，如必需使用勿超過 0.01%。
(10) 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
(11) 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作，且戴手套可以避免在印記膜上留下手印。
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答：可能的原因有：
1、目的蛋白有多個修飾位點，本身可以呈現(xiàn)多條帶，建議查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小；
2、樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解,建議加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作；
3、雜蛋白多，建議處理目的蛋白；
4、抗體特異性不強，建議使用特異性強的抗體；
5、抗體孵育時間過久，建議減少抗體孵育時間；
6、二抗與抗原有交叉反應，建議選擇合適的封閉物；
7、二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質(zhì)變性過程及強度；
8、底物顯色與曝光時間過長，建議縮短顯色及曝光的時間。
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