可能原因                         解決措施是
1，酶標儀設置不正確            檢查儀器波長
2，沒加終止液                      加入適量終止液
3，讀板時等待時間太長        及時讀板

當細胞培養實驗需更換血清品牌時，做程序性梯度替換方案尤為重要，因為不同品牌的血清所含成分有所差異，血清更換會使細胞發生不適，從而出現細胞增殖緩慢或細胞狀態不佳等情況。

血清梯度替換過程如下：

（1）用20%新血清與80%原血清進行混合，培養傳代1-2次；

（2）用50%新血清與50%原血清混合培養傳代；

（3）再用80%新血清與20%原血清混合培養傳代；

（4）完全使用新血清培養傳代。

由于在37℃的溫度下培養，會加劇纖維蛋白的析出和磷酸鈣顆粒產生，可采用空培方式驗證污染，血清按所需比例加入無菌培養基中（不加雙抗），放培養箱中過夜，觀察空培外觀，若為澄清，則血清無污染。還可以通過將血清接種在細菌培養基上進行培養，觀察是否存在細菌增殖，并且進行革蘭氏染色，用油鏡觀察直接判斷是否為微生物污染。

血清中產生沉淀原因可能是：

① 血清熱滅活；② 37℃ 孵育；③ 頻繁的解凍與凍存操作；④ 解凍過程中未混合；⑤ 經γ-輻照；⑥ 2-8℃ 長時間儲存；如果血清中含有沉淀，

若去除這些絮狀沉淀物，可將血清分裝至無菌離心管中，以3000rpm離心5-15min，去除大顆粒沉淀，收集上清液加入培養基內一起過濾。

一旦在細胞培養的過程中發現有黑點生成，首先，要肉眼觀察培養基是否混濁，然后，在鏡下觀察培養細胞生長的狀態，黑點是否游動。如果細胞被污染，微生物則會大量繁殖，培養基就會迅速變黃、變混濁。污染包括細菌污染、支原體污染等。如果在鏡下觀察細胞，生長狀態良好，與黑點出現前相比，沒有任何變化，那么，黑點的出現可能與以下幾種情況有關:

(1)細胞生長過老，破碎的細胞殘骸;

(2)配制培養基的pH值偏高，不宜細胞生長;

(3)培養原代細胞中出現小黑點，可能是原代組織中的雜質，多次傳代可以消除;

(4)血清等級不足以維持細胞良好的生長，更換高等級的胎牛血清。

不是！免疫熒光抗體是用于免疫熒光試驗的，是用FITC或PE等標記的抗體，結果需要紫外線激發并用熒光顯微鏡觀察WB抗體一般是HRP或堿性磷酸酶等標記的抗體，需顯色底物（如TMB等）直接顯色（肉眼）或化學發光法顯影（需特殊儀器）。

1.Triton X-100 化學名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學(>10um 厚切片) 和免疫細胞化學中一般用 Triton X-100 作為細胞通透劑，在膜上打孔。既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用。

2.作用原理：Triton X-100 可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質而使抗體及大分子結構的物質進入胞漿和胞核內，故在細胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進入胞內與相應抗原結合。

 1.防止切片從 4 度直接放入 PBS 易脫片；

 2.使抗原抗體結合更穩定。通常情況下不需要,但對表達較弱的抗原可能有用。4 度和 37 度時分子運動方式不同, 前者分子碰撞機率和運動速度小于后者，后者結合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。

1.DAB 顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現淺棕色本底時即可沖洗； 

2.DAB 顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現很深的棕褐色，這很可能說明抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調抗體濃度或縮短抗體孵育時間； 

3.若很短時間就出現背景很深，還有可能前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；

4.DAB 顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現陽性染色，可能由于抗體濃度過低或孵育時間過短（好一抗 4 度過夜）或者是封閉時間過長。 

使用常規封閉手段如脫脂乳封閉需要室溫下孵育90min，使用普美無血清封閉液可室溫下15-30min。